导入
乳腺癌干细胞(BCSC)可以促使癌细胞的转移和复发，是导致许多乳腺癌患者出现不良结果的主要原因。BCSCs在缺氧环境中更为普遍，但这一环境也使BCSCs用传统化疗方案难以达到治疗目的。本文中的小分子构建体AzCDF，它允许针对BCSCs进行治疗，并且在通常难治的缺氧肿瘤环境中有效。
对于已开发出允许癌症干细胞CSC成像的相关系统AzNap。AzCDF中加入了几个设计元素，包括通过碳酸酐酶IX(CAIX)抑制剂乙酰唑胺(Az)以促进MDA-MB-CSCs中的定位，二甲基硝基噻吩亚基作为缺氧触发剂，以及3,4-二氟亚苄基姜黄素(CDF)作为易于释放的治疗有效载荷。这使得AzCDF可以作为一种低氧分子平台，选择性地靶向BCSC，从而减少CSC迁移，延缓肿瘤生长，并降低肿瘤发生率，体外和体内研究的结合证明了这一点，也是第一次在动物模型中证明靶向CSC的小分子可以预防肿瘤发生。还制备了两个缺乏靶向系统的药物负载体（R-CDF）或缺乏药物部分的CSC靶向单元（R-Az）。
Notch和Wnt信号在乳腺癌和胃癌中对于CSC增殖、转移和干细胞性中的潜在作用。因此，靶向缺氧微环境可以提供一种消除CSC群体的方法。该团队设计的AzCDF作为一个药物递送系统平台，将CDF选择性地传递给表达CAIX的缺氧CSCs，可以在缺氧乳腺癌肿瘤中观察到CSCs的选择性根除(图1b)。
AzNap和AzCDF的体外还原激活
偶联物AzCDF和AzNap被设计为靶向CSCs，并允许在缺氧条件下传递活性有效载荷CDF或荧光团萘酰胺。AzNap和AzCDF的体外还原激活，图2a、b中提供了在模型缺氧条件下分别从AzNap和AzCDF释放活性荧光团和建议的治疗有效载荷CDF的描述。在这里，通过在NADH存在下使用大肠杆菌硝基还原酶(NTR)作为模型还原剂来评估二甲基硝基噻吩基团的还原和随后荧光团或CDF的释放。
从上图a、b中可以看出，AzNap在30分钟内达到饱和的情况下，可以看到nm处的浓度和时间依赖性荧光发射特征。这一发现与提议的荧光染料释放一致，CDF具有微弱但显着的吸光度，最大强度约为nm。AzCDF预计会有类似的发布概况。事实上，当AzCDF受到用于AzNap的模型还原条件时，可以看到CDF特有的吸光度特征（图3c）。此外，HPLC测定显示AzCDF确实，并且在6小时内完全释放CDF（图3d）。在此基础上，研究人员认为AzNap和AzCDF都可能靶向缺氧肿瘤环境中的CSC。
缺氧CSCs中AzNap和AzCDF激活的验证
进一步分析，研究人员发现MDAMB-细胞携带17%的CD抗原，可使用磁激活细胞分选(MACS对CD+细胞)进行分类(图4a和图S34)。随后用Western印迹法证实了该抗原的存在，反映了MACS分选后CD的强烈富集，CD通过第二次亚培养维持了CD的表达(图4b)。通过使用荧光替代物AzNap，评估了本研究中使用的药物偶联物(AzCDF)的潜在传递情况。如图4c和图S35可以看出，在轻度缺氧条件下（3%氧气）的癌细胞中，可以清楚地观察到AzNAp释放的萘的亮绿色荧光。为了支持这种摄取机制，研究人员使用了CAIXsiRNA介导的基因敲低细胞模型。当维持在3%O2下时，只能在用scrambledsiRNA对照处理的CD+MDAMB-细胞中观察到由AzNap激活产生的明亮荧光。研究人员将这一发现作为CAIX参与AzNap细胞摄取的证据（图4d和图S38）。在常氧和缺氧条件下，对CD+和CD?MDA-MB-细胞评估了AzCDF和参考化合物R-CDF和R-Az的细胞毒性，显示出显著不同的行为(图4e和图S43)。在常氧条件下，细胞活力基本上不受AzCDF、R-CDF或R-Az存在的影响。这被认为是二甲基亚硝基噻吩触发器的稳定性（以及相应的缺乏药物释放）的进一步证据。对于CD+和CD?MDA-MB-细胞群，观察到对AzCDF细胞毒性的剂量反应依赖，在CD+细胞群中可以看到更高的毒性。这一结果可能反映了这些表达CAIX的细胞中更大程度的AzCDF摄取。因此，它反映了这些细胞中AzNap荧光强度的增加，以及之前报道的az诱导的CSC消耗。值得注意的是，虽然AzCDF在缺氧条件下表现出最显著的细胞毒性，但R-CDF在这些条件下的毒性很低，但不可忽略。这一发现归因于醌甲基物的释放（和类似的活性硫吩衍生物；见图2）以及固有的Az活性，这使研究人员认为AzCDF的作用不仅取决于CDF释放和CAIX抑制，还取决于醌甲基化物的生成（见下文）。
利用三维肿瘤球状体进行的肿瘤发生的研究
为了进一步研究AzNap和AzCDF推测的缺氧激活，我们使用了三维肿瘤球状体。肿瘤球状体被认为是一个很好的模型系统，因为它们模拟了实体肿瘤的几个关键特征。最值得注意的是，球状体和实体肿瘤都具有缺氧的核心，反映了氧向核心细胞的运输，在这两种情况下都受到扩散限制。
研究人员使用了来自未分类细胞以及CD-和CD+细胞群的MDA-MB-肿瘤球体。从图5a中可以看出，在常氧条件下与AzNap共培养的肿瘤球体的特征在于相对于未分类的MDA-MB-细胞或CD-细胞具有更高水平的荧光CD+细胞。这种荧光归因于球体缺氧核心中AzNap的激活。HIF1α（细胞缺氧的关键标志物）以时间依赖性方式的表达提供了支持这些球体中存在缺氧核心的证据（图S44）。这一发现为这项研究的假设提供了支持，即CAIX归巢和相关的缺氧依赖性有效载荷释放受益于CSC选择性，这种选择性不仅在原代细胞培养中有效，而且在组织模拟肿瘤球体中也有效。
基于上述影像学研究，用AzCDF治疗肿瘤球状体。将得到的肿瘤球状体冷冻切片，用碘化丙啶(PI)和Calcein-AM染色(图S45)。在缺氧条件下生长的球状体中可见PI的红色荧光，表明死亡细胞，而来自calcein-AM的绿色荧光减少。DMSO处理的对照组，保持在正常氧或3%氧气下，未显示PI荧光。因此，我们使用AzCDF和AzNap用PI染色共处理球状体，以测试它们的同时功能(图5b)。在常氧条件下生长的球状体表现出与球状体核心对应的明显模式。相比之下，在3%O2下生长的球体在整个球体区域都显示出PI和萘的荧光信号。为了评估这些CD+MDAMB-肿瘤起始细胞的自我更新能力，在球状体形成的第二天，用5.0nM的R-Az、R-CDF或AzCDF处理肿瘤球状体，并随机选择在常氧或低氧条件下(3%O2)下进一步孵育。在第5天，分析显示，在缺氧条件下保留的球状体较少，其中AzCDF处理的缺氧孵育细胞的球状体数量减少最大(图5c，d)。在此基础上，研究人员得出结论，释放的CDF可以有效地杀死CSCs，从而导致肿瘤起始特性的下调。在常氧条件下生长的球状体也显示出一些活力的降低。这一发现是合理的，因为在常氧条件下生长的细胞一开始受影响较小；然而，随着时间的推移，产生一个缺氧核心，触发CDF释放。
在AzCDF的体内治疗效果和AzNap的选择性荧光成像中
为了检测目前药物传递平台的肿瘤和CSC归巢在体内是否有效，研究人员使用MDA-MB-细胞异种移植物携带小鼠进行了研究。如图7a和图S51所示，单次尾静脉注射AzNap后，很容易观察到异种移植物的荧光，注射小时后仍然显著。切除组织的体外成像证实了与肿瘤相对应的强荧光，但几乎没有来自任何重要器官的荧光(图7b)。
MDA-MB-细胞移植物用R-Az、R-CDF或AzCDF处理的小鼠通过尾静脉注射（每周一次，连续3周）显示，在azCDF处理的小鼠中，肿瘤生长率显著降低(图7c，d)。R-Az或R-CDF组相对较小的生长减少，与该课题的设计预期一致，即需要一种有效的药物(CDF)和基于az的CSC靶向才能产生较强的抗肿瘤作用。化合物依赖的体内肿瘤生长减少反映在切除肿瘤的大小差异上(图7e)。重要的是，本研究的药物通常耐受性良好，反映在最终体重(图S52)，以及从重要器官的玻片进行HE染色时缺乏主要病理体征(图S53)。
为了评估AzCDF在体内预防肿瘤发生的能力，首先对CD+MDA-MB-MACS细胞进行MACS分类，如上所述。然后将这些细胞与DMSO或AzCDF在缺氧条件下孵育6小时。使用锥虫蓝测定活细胞的数量，并将两种孵育方案的相同活细胞数量注射到裸鼠中，以确定肿瘤的起始程度(图7f)。在注射到小鼠体内之前使用缺氧条件被认为是必要的，因为特别是在AzCDF的情况下，有必要保持细胞存活的同时抑制细胞的干性。6周后，在注射azcdf处理细胞的动物的情况下，观察到肿瘤发生的显著和显著的差异(图7g、h和图S54)。相比之下，注射相同数量的DMSO处理细胞的小鼠显示出快速的肿瘤生长。一致认为，该肿瘤发生研究的结果与上述机制分析一致，其中AzCDF用于抑制干细胞相关基因和蛋白质。因此，研究人员得出结论，AzCDF体现了一种潜在的强大策略，可用于克服归因于CSC的肿瘤发生。
总之，该课题组开发了成对的分子平台AzNap和AzCDF，分别用于成像和治疗干预。两种探针均设计用于靶向CSC。必要的CSC靶向是通过使用CAIX靶向配体实现的。在AzCDF的情况下，活性亚基CDF的有条件释放发生在缺氧条件下。发现该试剂引起细胞活力的统计学显着降低，尤其是在MDA-MB-细胞的CD+CSC群体中。释放的药物CDF的效力被认为会因氧化还原稳态的破坏而进一步放大，这种影响在分选的CD+细胞中最为明显。在体外轻度缺氧(3%O2)下，AzCDF的特征是一个数纳摩尔IC50值，而在常氧条件下几乎没有观察到毒性。基于细胞的结果很好地转化为体内环境，这反映在施用AzCDF后小鼠模型中MDA-MB-细胞异种移植肿瘤的明显衰减。还观察到体内肿瘤发生的有效抑制。总体而言，AzCDF代表了选择性根除CSC的潜在一步，并且可能在适当的时候克服肿瘤复发。AzNap为AzCDF提供了补充，可证明其可用于高度侵袭性癌症的早期诊断。本研究旨在强调多模式药物在克服归因于乳腺癌干细胞(BCSC)的不良临床结果方面可能必须发挥的作用。
本文作者：GSH
责任编辑：WSY
本文链接：DOI:10./jacs.1c
GeTeam
